国家自然科学基金（８１８７１７２５）
目的 确定 ＬｎｃＲＮＡ ＰｉＨＬ 在奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞中的作用并探讨其作用机制。方法 采用 ＣＣＫ８ 法检测奥 沙利铂对结直肠癌细胞的抑制率，体外构建奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞系，ｑＲＴＰＣＲ 检测结直肠癌细胞中 ＰｉＨＬ 的表达水 平；利用分子克隆技术构建稳定过表达 ＰｉＨＬ 的正常结直肠癌细胞系和稳定干扰 ＰｉＨＬ 的奥沙利铂耐药结直肠癌细胞系，ＣＣＫ８ 法和流式细胞术检测 ＰｉＨＬ 表达水平的改变对奥沙利铂作用下细胞的存活率和凋亡比例的影响；ＴＣＧＡ 数据库分析和 ｑＲＴＰＣＲ预测 ＰｉＨＬ 与多梳抑制复合物 ２（ＰＲＣ２）途径基因之间存在的相关性；ＲＮＡ ｐｕｌｌｄｏｗｎ 和 ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 确定 ＰｉＨＬ 与 Ｚｅｓｔｅ 增强子同源物 ２（ＥＺＨ２）之间的作用关系；ＲＮＡｓｅｑ 与 ｑＲＴＰＣＲ 结合确定 ＰＲＣ２ 表观遗传作用靶点。结果 耐药细胞系中 ＰｉＨＬ 的表达水平较正常细胞显著升高。稳定过表达 ＰｉＨＬ 细胞后对奥沙利铂的敏感性降低。同时，在耐药结直肠癌细胞系 中，干扰 ＰｉＨＬ 表达组药物作用下细胞存活率明显低于对照组，细胞对奥沙利铂敏感性增加。ＴＣＧＡ 数据库分析发现 ＰｉＨＬ 表 达和 ＰＲＣ２ 的组成成分 ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ 的表达水平存在显著正相关，ｑＲＴＰＣＲ 确认结直肠癌组织样本中 ＰｉＨＬ 的表达与 ＥＺＨ２ 呈正相关；在 ＨＣＴ１１６ 细胞中，ＲＮＡ ｐｕｌｌｄｏｗｎ 和 ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 结果显示，体外转录的 ＬｎｃＲＮＡ ＰｉＨＬ 可以与细胞中 ＥＺＨ２ 蛋 白直接结合；过表达或敲除 ＰｉＨＬ 后，ＥＺＨ２ 蛋白的表达水平并不改变。ＰｉＨＬ 表达下调可以显著增加细胞周期蛋白依赖性激 酶抑制剂 ２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）、ＫＬＦ２、ＫＬＦ６、人类 ＲＵＮＴ 相关转录因子 ３（ＲＵＮＸ３）等抑癌基因的表达。结论 ＰｉＨＬ 在奥沙利铂耐药 结直肠癌细胞中高表达。ＰｉＨＬ 可以促进结直肠癌细胞奥沙利铂耐药，耐药细胞中干扰 ＰｉＨＬ 表达可以抑制细胞增殖，促进药 物诱导的细胞凋亡，提高奥沙利铂的敏感性。ＰｉＨＬ 通过与多梳抑制复合物中的 ＥＺＨ２ 蛋白结合表观遗传抑制的抑癌基因 ＣＤＫＮ２Ｂ、ＫＬＦ２、ＫＬＦ６、ＲＵＮＸ３的表达。
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｌｎｃＲＮＡ ＰｉＨＬ ｏｎ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ （ＣＲＣ） ｃｅｌｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ ｏｎ ＣＲＣ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＣＣＫ８ ａｓｓａｙ． Ｔｈｅ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＣＲＣ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＰｉＨＬ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｑＲＴＰＣＲ． Ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ＣＲＣ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｓｔａｂｌｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＰｉＨＬ ａｎｄ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＣＲＣ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｓｔａｂｌｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＰｉＨＬ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ ｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ＰｉＨＬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｘａｌｉ ｐｌａｔｉｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＣＣＫ８ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｉＨＬ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ２ （ＰＲＣ２）ｐａｔｈｗａｙ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＴＣＧＡ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｑＲＴＰＣＲ． Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＰｉＨＬ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎ ｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｚｅｓｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ２ （ＥＺＨ２）ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＲＮＡ ｐｕｌｌｄｏｗｎ ａｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ． Ｔｈｅ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ＰＲＣ２ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒ ｍｉｎｅｄ ｂｙ ＲＮＡｓｅｑ ａｎｄ ｑＲＴＰＣＲ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＰｉＨＬ ｉｎ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＣＲＣ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ＣＲＣ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＲＣ ｃｅｌｌｓ ｓｔａｂｌｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＰｉＨＬ ｔｏ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ ｗａｓ ｒｅｄｕｃｅｄ． Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｎ ｔｈｅ ｏｘ ａｌｉｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＣＲＣ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｓｔａｂｌｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＰｉＨＬ，ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ． Ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴＣＧＡ ｄａｔａ ｂａｓｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＰｉＨＬ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ＰＲＣ２ ｓｕｃｈ ａｓＥＺＨ２，ＳＵＺ１２ ａｎｄ ＥＥＤ，ａｎｄ ｑＲＴＰＣＲ ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＰｉＨＬ ｉｎ ＣＲＣ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＥＺＨ２． Ｉｎ ＨＣＴ１１６ ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＲＮＡ ｐｕｌｌｄｏｗｎ ａｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｎｃＲＮＡ ＰｉＨＬ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｕｌｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｂｉｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ＥＺＨ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＥＺＨ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｄ ｎｏｔ ｃｈａｎｇｅ ａｆｔｅｒ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｒ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ ＰｉＨＬ． Ｔｈｅ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｉＨＬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２Ｂ （ＣＤＫＮ２Ｂ），ＫＬＦ２，ＫＬＦ６ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＲＵＮＴ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ３ （ＲＵＮＸ３）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＰｉＨＬ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＣＲＣ ｃｅｌｌｓ． ＰｉＨＬ ｃａｎ ｐｒｏｍｏｔｅ ＣＲＣ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｒｅｓｉｓｔ ｏｘ ａｌｉｐｌａｔｉｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰｉＨＬ ｉｎ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅｉｒ ｄｒｕｇｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅｉｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ． ＰｉＨＬ ｃａｎ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＣＤＫＮ２Ｂ，ＫＬＦ２，ＫＬＦ６ ａｎｄ ＲＵＮＸ３ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＥＺＨ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＰＲＣ．
李思,田思雨,袁宏. LncRNA PiHL 在奥沙利铂耐药结直肠癌细胞中的作用 及初步机制[J].临床检验杂志,2021,39(9):694-700